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文章题目：具核梭杆菌定植乳腺癌加速肿瘤生长和转移
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2020. 6
具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）是一种常见的口腔非芽孢形成的革兰氏阴性厌氧菌。此前报道，F. nucleatum在结直肠癌（CRC）中广泛存在，会促进肿瘤发生。F. nucleatum是在发生一过性菌血症（transient bacteremia）时进入血液，并借助其表面暴露的凝集素Fap2与结直肠癌（CRC）组织结合。这种结合是由Fap2识别CRC细胞中大量表达的糖Gal-GalNAc达成的。
既然口腔F. nucleatum可以通过血源性转移到CRC，那么它是否可以通过这种途径结合富含Gal-GalNAc的其他器官的肿瘤？顺着这个猜想，作者对不同的癌症组织样本进行Gal-GalNAc筛查，筛出乳腺癌为突出的候选者。此前已有报道乳腺癌中表达Gal-GalNAc，并且在乳腺癌微生物群中有高丰度的Fusobacterium属的DNA。由此，作者想要弄清楚，F. nucleatum在乳腺癌中发挥的作用是否与在CRC中是一样的。
16S rRNA基因测序，RNA-seq，组织芯片，免疫组化
1. Gal-GalNAc在乳腺癌中过度表达
作者首先使用组织芯片分析乳腺癌组织和配对癌旁组织，证实乳腺癌样本中的Gal-GalNAc水平显著高于相匹配的邻近癌旁组织。接着比较了正常人乳腺组织、乳腺肿瘤组织(包括良性肿瘤)以及乳腺癌发展过程中不同阶段的组织样本中的Gal-GalNAc水平。组织芯片结果显示，Gal-GalNAc信号在正常组织和增生组织中最低。非典型增生和恶性组织的Gal-GalNAc水平分别比正常组织高24倍和4.7倍。按乳腺癌亚型做比较，粘液腺癌(mucinous adenocarcinoma)显示的Gal-GalNAc含量比测试的其他五个癌症亚型至少高出两个数量级。
图1 Gal-GalNAc在乳腺癌中过度表达
2. F. nucleatum gDNA在乳腺癌中呈高丰度
作者构建了来自不同乳腺癌样本的50个16S rDNA测序文库，从中搜索F. nucleatum特异性序列。由于乳腺肿瘤细菌生物量低，作者纳入了50个空DNA提取物(controls)和50个无模板PCR对照(NTCs)，作为DNA污染的阴性对照。用21例CRC样本的DNA作为阳性对照。在30%和57%被检乳腺肿瘤和CRC样本中检测出F. nucleatum，F. nucleatum主要在那些含有高水平Gal-GalNAc的乳腺癌样本中检出。该结果不仅证实了以前观察到的梭菌属在乳腺癌微生物组中普遍存在，而且预示Fap2-Gal-GalNAc相互作用在梭菌定植乳腺癌组织中起重要作用。
图2 F. nucleatum gDNA在含有高水平Gal-GalNAc的乳腺癌中更多
3. Fap2是通过Gal-GalNAc结合乳腺癌
作者使用前期构建的F. nucleatum ATCC 23726的两个Fap2缺陷突变株K50和D22来一起确定F. nucleatum是否也能通过Fap2特异性地结合到乳腺癌细胞上。使用包含恶性肿瘤和非癌(正常和良性)人乳腺组织样本的芯片，作者发现携带Fap2的野生株(WT) ATCC 23726对恶性乳腺癌切片的结合显著高于对正常或良性乳腺肿瘤切片的结合。相比之下，Fap2缺失的K50突变株对恶性乳腺癌组织的结合显著受损，而它对正常乳腺切片或良性组织的结合与WT相似。
作者接着使用流式细胞术比较了WT和Fap2缺失的F. nucleatum对多种乳腺癌细胞系（小鼠AT3和4T1，以及人MCF-7）的结合情况。以小鼠黑色素瘤细胞系B16为阴性对照。所有三个测试的乳腺癌细胞系都表达出比B16更高的Gal-GalNAc水平。F. nucleatum只结合在乳腺癌细胞系上，WT对乳腺癌细胞的结合显著高于K50和D22突变株，这支持Fap2介导Gal-GalNAc识别的猜测。当加入可溶性GalNAc会抑制上述结合，这可能是把Fap2凝集素饱和了。这些结果有力地证明了F. nucleatum主要借助Fap2凝集素来定位具有高水平Gal-GalNAc的乳腺癌组织。
图3 F. nucleatum对乳腺癌的结合是由Fap2介导并依赖于Gal-GalNAc
4. F. nucleatum倾向定植于乳腺癌组织且由Fap2介导
一过性菌血症在牙周病中很常见，为口腔梭菌进入循环系统提供了机会。一旦进入血液，F. nucleatum可能通过血源性转移到乳腺癌。为验证这一点，作者对4T1原位移植的乳腺癌BALB/c小鼠的血管内注射F. nucleatum来模拟一过性菌血症。接种24小时后进行组织分析，与人类乳腺癌样本一致，小鼠癌症切片中的Gal-GalNAc水平比匹配的正常组织切片中的水平高，并且观察到F. nucleatum gDNA在肿瘤切片中的丰度比匹配的正常组织中的至少高出两个数量级。相比之下，作者使用相同的处理却未能在对照无肿瘤小鼠的乳腺中检测到细菌，这表明血液中的F. nucleatum需要肿瘤的存在才能定位到乳腺组织。
为验证F. nucleatum在不同动物模型中定植乳腺癌的情况，并评估Fap2在这个过程中的作用，作者使用AT3原位移植的乳腺癌C57BL/6小鼠进行实验。这一次注射了野生型F. nucleatum ATCC 23726，Fap2缺陷型F. nucleatum K50，或革兰氏阴性厌氧牙周细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, ATCC 33277)作为对照。P. gingivalis在口腔鳞状细胞癌中丰度过高。接种24小时后，对邻近乳腺的肿瘤和未受影响的组织进行分析。与上述BALB/c模型一致，通过菌落计数和qPCR检测，与邻近正常组织相比，F. nucleatum ATCC 23726在肿瘤组织中富集。与WT相比，Fap2缺陷(突变株K50)会导致乳腺肿瘤的定植至少下降三个数量级。这些暗示，虽然肿瘤组织在富集F. nucleatum的过程中起着关键作用，但是乳腺癌中特异性富集F. nucleatum关键是由Fap2驱动。与F. nucleatum定植CRC相同，乳腺肿瘤并不是被任何与牙周炎相关的口腔厌氧菌定植的。在接种了P. gingivalis的小鼠中，肿瘤中的细菌数量低于检测下限。F. nucleatum可能是具有独特的肿瘤定植特性，如Fap2。
为直观地观察梭菌定植乳腺癌的情况，作者用多光子显微镜追踪了动物体内用FITC标记的F. nucleatum ATCC 23726。注射PBS(注射细菌的载体)作为对照。接种24小时后，作者在所有肿瘤样本中都检测到梭菌信号，而在邻近的正常乳腺样本和假接种小鼠的样本中均未检测到信号。
5. 抗生素抑制F. nucleatum诱导的肿瘤恶化
已报道F. nucleatum定植会加速结肠肿瘤的形成，作者使用AT3乳腺癌模型来测试其是否也影响乳腺癌的肿瘤进展，实验方案参照图5a。将乳腺癌小鼠随机分为5个处理组(血管注射或接种)：PBS载体组(V)、野生型F. nucleatum ATCC 23726 (726)或Fap2突变株(K50)，F. nucleatum ATCC 23726并加甲硝唑处理(726+MTZ.)，或单独甲硝唑处理(MTZ.)。接种F. nucleatum ATCC 23726，而非K50菌株的小鼠，显示出比对照组显著更大的肿瘤。单独用甲硝唑处理并不影响肿瘤大小，但确实阻止了接种了梭菌小鼠的肿瘤扩大。
此外，接种F. nucleatum ATCC 23726的小鼠相比假接种组会显著促进肿瘤的肺转移。而K50菌株虽对转移有些促进但不显著。甲硝唑处理会阻止F. nucleatum的促肿瘤转移作用。
图5 F. nucleatum ATCC 23726会加速肿瘤生长和肺转移进展
6. F. nucleatum调节对乳腺肿瘤的免疫力
F. nucleatum是通过何种途径促进肿瘤增长？作者排除了两种可能：(1)促进癌细胞的增殖；(2)抑制癌细胞的凋亡。根据F. nucleatum在CRC中发挥作用的机制，猜测其在乳腺癌中可能也是操纵抗肿瘤免疫。通过流式分选实验，作者发现接种F. nucleatum的小鼠乳腺肿瘤中携带较少的CD4+和CD8+T cells。
为考察免疫细胞在F. nucleatum促进肿瘤进展中的作用，采用缺失T、B、NK细胞的SCID-beige小鼠进行接种，发现未接种的SCID-beige小鼠的肿瘤并不比接种小鼠的小。这表明，F. nucleatum直接或间接地抑制了免疫介导的肿瘤控制。
此外，通过分析RNA-seq数据，作者发现F. nucleatum接种的AT3细胞会过表达matrix metalloproteinase 9（MMP-9），而MMP-9的活动与包括侵袭、血管生成和转移等癌症病理相关。诱导MMP可能是F. nucleatum加速乳腺肿瘤进展的另一个途径。
本研究从F. nucleatum在CRC中的研究发现出发，提出合理假设——F. nucleatum是否也结合富含Gal-GalNAc的乳腺肿瘤并在其中发挥作用？围绕假设，作者使用多种检测手段，并结合in vitro和in vivo实验，严谨且扎实地展示和证实F. nucleatum是如何定植到乳腺肿瘤中，又在乳腺肿瘤中发挥何种作用，最后揭示出发挥作用的潜在机制，整个设计值得借鉴。对肿瘤微生物组这个崭新课题做研究，站在前人工作的基础上，发散思路，举一反三，会是一条事半功倍的研究路径。
参考文献
Parhi L, Alon-Maimon T, Sol A, et al. Breast cancer colonization by Fusobacterium nucleatum accelerates tumor growth and metastatic progression. Nat Commun. 2020 Jun 26;11(1):3259.
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